第十章 分化控制
克隆蛙、克隆羊和基因分析的结果说明体细胞中含有整套的基因组，也就是说任何一个细胞都含有全套的DNA，从遗传信息的角度看，只要经过适当的诱导任何一个细胞都可以发育为一个个体，这其中也包括了所有的组织和器官。如果有一天人类彻底控制了分化，就可以根据需要培养出所需要的组织、器官、血液成分为临床治疗服务。经过了许多生物学、医学工作者的不断努力，在分化控制方面已经取得了很大的进展，但是离最后的目标还有相当的距离。本章中将人为的改变分化方向称为分化控制。
一、分化诱导
胚胎诱导和分化有着十分密切的关系，在多细胞生物体中，每个细胞与其临近的细胞相联，没有一个细胞可以独立于其周围的细胞而进行分化，因此一些细胞对另一些细胞的影响是决定分化的重要方面。产生影响的细胞或组织称为诱导者；接受影响的组织或细胞称为反应者，反应者必须具备感受性。
用两栖类做实验，将蝾螈胚胎中将来发育为晶体的外胚层部分切除，用其它部分的外胚层代替，这种代替组织有发育为外胚层的能力。如果将视杯切除并移植到其它部位的外胚层下面，则这里的外胚层就发育为晶体。不仅如此，当把蝾螈的晶体切除后，虹膜上皮细胞即失去色素并获得分裂能力，然后分化为晶体细胞并合成晶体蛋白。在蝾螈，虹膜形成晶体的能力是在幼虫阶段获得，该种能力可以保持到成体阶段。鸡的色素细胞转化为晶体能力在胚胎发育早期存在，以后该能力逐渐下降最后消失。
翅部中胚层 + 腿部外胚层 腿部中胚层 图10.1 鸡胚羽毛和鳞片分化诱导
另外一个关于分化诱导的有趣实验是用鸡胚研究长羽毛还是长鳞片（图10.1）。将鸡胚腿部（鳞片区）中胚层细胞移植到翅部（羽毛区）外胚层下，结果翅部分化出腿部的鳞片。将羽毛区中胚层移入鳞片区外胚层下，结果长出羽毛。可见，鸡胚的外胚层细胞有分化为羽毛和鳞片两种特征，具体分化为何种结构由中胚层的诱导决定。这些实验说明，在一定的时期通过适当的诱导可以改变分化方向。
二、干细胞的分化
受精卵分化为原始干细胞，接着形成胚泡，胚泡中的内细胞团分化为不同的组织（图10.2）。
原始干细胞 胚泡 血液 神经 肌肉 卵子 内细胞团 图 10.2 原始干细胞 有人认为受精卵形成一个原始干细胞（左图），另有人认为细胞分裂若干代以后形成原始干细胞存在于内细胞团。不管那种说法，干细胞可以分化为血液，神经，肌肉等组织。
精子
胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是由早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养，在传代过程中筛选出的具有全能性的细胞。ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆细胞周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。ES细胞的全能性是其有别于成纤维细胞等细胞的显著特点。在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就会自发地进行分化。由于大鼠肝细胞等条件培养基的应用和细胞分化抑制因子DLA/LIF的发现、纯化和生产，现可以用条件培养基或LIF代替饲养层细胞，使培养的ES细胞处于不分化状态。除去这些分化抑制物，在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养可形成“简单类胚体”进一步培养可形成“囊状胚体”，使简单类胚体重新附着于培养皿上生长，可形成不同种类复杂的细胞分化物。ES细胞在体外某些物质诱导下可以发生定向分化，如用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导剂，辅以双丁酰环腺苷单磷酸对单层培养的ES细胞进行诱导分化，90%以上的ES细胞分化为神经胶质细胞，聚集培养的ES细胞可诱导分化为有节律性收缩的心肌细胞。
将ES细胞通过注射法或聚合法与受体胚胎结合并将胚胎移植同期化受体可以得到嵌合体动物。嵌合体动物可以通过毛色、皮肤色素等进行判断，或取器官组织同功酶（如GPI，磷酸葡萄糖异构酶）检测。1990年Petitte等将芦花鸡的胚盘细胞注入白来航鸡胚盘中，制备了嵌合体，其中一只为种系嵌合体，Naito等（1991年）将鹌鹑的胚盘细胞移植到鸡的胚盘中获得了来自供体的后代，有些文献报道在囊胚期胚盘中已鉴定出原始生殖细胞的存在，因此人们认为操作囊胚期胚盘细胞同时也操作了其中的原始生殖细胞，Chang(1995)、Tajima(1998)移植生殖腺的原始生殖细胞获得了供体的后代。这些实验证明外源原始生殖细胞可以在受体生殖腺中定居为有功能的配子，也可以作为转基因的靶细胞微注射移植胚盘细胞或原始生殖细胞的方法都可以获得种系嵌合体。并为体外基因操作赢得了机会和时间。相比下，胚盘细胞移植法操作较容易，易大量制备，但种系嵌合体形成比例较低，原始生殖细胞移植法操作较难，不易大量制备，但是种系嵌合体形成比例较高。李赞东等在1999年参考了以上实验研究内容，以羽毛作为标记，供体选择了中国原种麻鸭，受体选择了纯种白来航鸡，用胚盘细胞移植法试图制备麻鸭与鸡的嵌合体，用0.25%胰蛋白酶处理获得分离麻鸭胚盘细胞，用直径为80μm 左右的微玻璃针吸取1-2μl 细胞悬液（含1000-2000个胚盘细胞）注入鸡胚盘的中央域，密封后，在适宜的条件下培养孵化。共获得了11只表型嵌合体，进一步实验证明，其中一只为性系嵌合体。麻鸭与鸡是遗传距离较远的动物，制备出了嵌合体，此模型将有希望应用于濒危鸟类的挽救及禽类转基因研究中。
三、诱导胚胎干细胞为造血细胞
体外从小鼠胚胎干细胞系（ES-D3）和人的受精卵分阶段诱导分化为造血干细胞，为临床应用与研究造血干细胞发育提供基础。造血干细胞是来源于早期胚胎细胞（包括桑椹胚及胚内细胞团）的高度未分化状态的细胞系。它具有向各种组织细胞分化的潜能。小鼠的胚胎干细胞分阶段培养或直接放置于饲养层细胞（某些细胞可以支持其它类型的细胞生长，称饲养细胞）上可以分化为各种造血细胞，包括红系，粒单系，巨核系，肥大细胞以及淋巴细胞（图10.3)。1995年Palacios报道将ES细胞置于含IL-3，IL-6和RP饲养层细胞上培养，并加入培养FLS4.1胎肝饲养层细胞系的上清液，培养5-7d后，将此诱导的细胞输注入已经致死量照射的受体小鼠，于15-20d后检测，胚胎干细胞诱导分化的细胞能重建致死量照射受体鼠淋巴、髓系和红系的造血功能。用小鼠胚胎干细胞系体外诱导，发现分阶段培养，在其发育的不同阶段使用不同的微环境，可使胚胎干细胞高效地向造血干/祖细胞分化。具体做法为，β-巯基乙醇（2-ME）可以使胚胎干细胞发育为胚胎体，干细胞因子（SCF）、IL-3、IL-6、血小板生成素（TPO）、EPO及粒系集落刺激因子（G-CSF）不利于胚胎体的形成。2-ME是在体外大多数细胞培养系中所用的促进细胞生长的物质，它可以与培养液中的半胱氨酸以二硫键结合形成复合物，使半胱氨酸更易进入胞浆，
红细胞 血小板 干细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 淋巴细胞 嗜酸细胞 嗜硷细胞 肥大细胞 粒细胞 巨嗜细胞
图 10.3 干细胞分化为不同血细胞
四、治疗心肌梗塞
有人移植骨骼肌进入患病的心脏，企图修复心脏的受损组织并且避免移植排斥，该技术在动物使用已经获得成功，通过对3个病人的试验性治疗在安全性上也获得成功。接受移植的病人使用一个微型泵维持心脏跳动直到移植结束。切下病人的骨骼肌，在体外培养，骨骼肌可以复制这一点与心肌不同，待骨骼肌复制到足够的数目，通过注射将培养的骨骼肌注射入受损的心脏，在部分病人已取得明显疗效，但是该种治疗方法的长期疗效以及移植的肌肉组织是否可以维持心肌的功能还需要进一步的观察。1998年有人报道家兔腿部肌肉可以替代严重受损的心肌功能。全世界每年有3百50万人患急性心肌梗塞，存活者也会留下严重的心肌损害，增加发生再次心肌梗塞的机会，再发展会出现充血性心力衰竭，心脏失去泵血能力。在所有被试验的动物，成肌细胞注射入受损心脏表现象正常心肌细胞一样，并改善细胞功能。干细胞如果注射入正常的心脏则表现为正常心肌，如果注射入受损的部位（瘢痕组织）则表现为瘢痕组织。
概括说，心肌梗塞入院病人先在急诊病房观察，接受常规治疗和支持疗法，切取一小块肌肉做体外培养，待2-3周以后培养细胞扩增到显著程度给病人做注射治疗。
五、成年骨髓干细胞可以分化为多种组织
原先认为只有胚胎干细胞有形成不同类型组织细胞的潜能，现在已经识别出在骨髓中的成年干细胞能形成肝、肺、皮肤和胃肠道，如果该项研究被证实那将意味着可以获得干细胞的新的来源。成年人和小鼠骨髓中的干细胞分化潜能比以往的认识要多，这是一个新的概念，可以形成肝组织。该种方法也利于基因治疗，干细胞在体外培养分化为特定的组织，导入一定的基因然后移植到人体的一定部位，这样可以使导入的基因仅在需要治疗的组织中表达。用X射线照射雌性小鼠，破坏其造血系统，然后输入同系雄性小鼠的骨髓，雄性小鼠细胞含有Y染色体，而雌性小鼠细胞不含Y染色体，借此标志可以把雄性小鼠和雌性小鼠的细胞区别开。结果发现，不仅在血细胞中检测到Y染色体，已知血细胞来自骨髓，而且在皮肤，肺和胃肠道也检测到Y染色体细胞，说明来自雄性小鼠骨髓的原始干细胞已经在雌性小鼠形成了新的特化组织。
六、干细胞移植
自身移植就是把自身的组织移植给自身，例如，乳腺癌病人接受了高剂量的化疗，通过 自身移植可以重建被化疗破坏的骨髓。用自身移植可以治疗的疾病包括乳腺癌，卵巢癌，非Hodgkin淋巴瘤，Hodgkin's病，某些白血病等。
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首先由移植小组确定病人是否适合移植，评价内容包括一般健康状况，疾病分期，是否有足够的支持。一旦确定病人适合移植，为了减少体内的肿瘤负荷需要做化疗。 |
持续1-4疗程的化疗，可以历时数月。反复测定病人的心、肺、肾和肝功能要求达到一定水平才可以做移植。对疾病也要重新评价以确定肿瘤在体内的残存数量。
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收集骨髓干细胞 |
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用适当的保护剂处理干细胞，通常是二甲亚砜，放入液氮中低温保存。
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对病人进行高剂量的化疗同时可以辅以全身放疗，希望杀死所有的肿瘤细胞，但是病人的造血系统也会被摧毁。 |
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由静脉将冷冻的干细胞重新输给病人.。 |
这些干细胞可以回到骨髓执行造血功能，重建造血系统，病人通常不发生移植物抗宿主疾病。
（二）同种异体干细胞移植
受者接受另外供者的干细胞称为同种异体移植。例如，白血病病人骨髓中存在肿瘤细胞
不适合做自身骨髓移植，这种病人在进行高剂量放疗和化疗以后，可以接受同种异体干细胞移植。还有另外一种移植叫同基因移植，供者的基因型与受者完全相同，在人类仅见于同卵双生子（女）病人。同种异体移植比自身移植复杂得多也危险得多。该种治疗方法用于治疗白血病，再生障碍性贫血，淋巴瘤，免疫缺陷综合症。
进行同种异体移植最重要的是要通过白细胞分型（HLA分型）找到合适的供者，首先从病人的亲属中寻找，一般选择同胞兄弟姐妹，必要时可以经由国际供者登记处帮助寻找合适的供者。在需要做同种异体干细胞移植的病人中只有30-38%的病人有幸找到HLA配型合适的供者。一旦选定供者，要确定供者的身体状况和干细胞的采集方法。
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干细胞可以冰冻保存或者在输注当天采集。受者接受高剂量放疗或化疗以后进行干细胞移植。接下来的治疗是防止移植物抗宿主病。
干细胞可以直接由骨髓采集，病人或供者在手术室中经过适当麻醉（一般需要全身麻醉），负责移植的医生使用大的骨髓穿刺针刺入髂骨吸出骨髓，虽然仅穿刺一个孔，但是穿刺针要经常转动以保证获得足够数量的细胞。
注射生长因子刺激骨髓，使骨髓产生干细胞并大量进入外周血，此时可以经由外周血采集干细胞。
每天注射粒细胞集落刺激因子或/和粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（G-CSF，GM-CSF）可以刺激骨髓。干细胞数目上升并进入血液。用血成分分离机收集干细胞，该种机器可以将血细胞分成不同的组分，留下含有干细胞的组分，其它的血液成分再回输给供者。每天进行成分分离数小时，直到收集到足够数目的干细胞。多数供者需要安放中央静脉插管，以确保良好的血液采集和回输。
干细胞采集完成以后，将其送入干细胞移植实验室。可以采用不同的方法处理干细胞以便贮存和移植。具体使用哪种处理方法根据病人的需要和所采集干细胞的类型确定。
外周血干细胞用预冷的M199营养液离心冲洗，去除不含细胞的上清液，干细胞的体积一般从300ml 减少到50 ml。骨髓干细胞也用这种方式处理，冲洗以后干细胞在血袋中平稳混合，然后置冰浴中。含有供者血浆，肝素和二甲亚砜的预冷溶液缓慢加入干细胞中，该种溶液在干细胞冷冻过程中起重要保护作用。血浆提供给干细胞贮存期的蛋白质，肝素防止干细胞凝集，二甲亚砜是冷冻保护剂用于防止细胞在冷冻过程中发生破裂。全部操作要在无菌条件下进行。
处理好的干细胞需要取出一份（＜5%）做干细胞计数和无菌试验。用自动血细胞计数器计数干细胞，确定白细胞总数和分类（淋巴细胞，单核细胞和粒细胞的比例），调整细胞浓度。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，通常移植的量为 1-10亿单个核细胞/kg 病人体重。
供者如果接受集落刺激因子（G-CSF）注射，外周血中干细胞的比例为总白细胞的 0.1% - 1%。骨髓中干细胞相对丰富，占总白细胞的0.5%-5% 。用CD-34荧光抗体可以检测干细胞，通常干细胞就是指CD-34阳性细胞。用流式细胞分检仪可以检测干细胞的比例，带有CD-34抗原的细胞可以和CD-34荧光抗体结合，用紫外线照射发出荧光，流式细胞分检仪可以识别并计数带荧光和不带荧光的细胞，所以能计算干细胞的比例。
干细胞处理的最后步骤是小份额（10滴）分装，液氮中低温保存。保存过夜后取出一份融化后确定干细胞活性，培养2周后显微镜计数集落（由单个细胞长成的一团细胞）数目，集落数目代表活的干细胞数目。经过这样的试验，并得到负责移植医生的认同，该干细胞贮存直到使用。
根据病人的特殊需要，其它处理干细胞的方法也可以采用。如果供者和受者ABO/Rh 血型不合，可以通过梯度离心去除红细胞和粒细胞（红细胞和粒细胞比重较大）。使用抗体，免疫磁珠，亲和层析可以将干细胞与其它所有细胞区别开，最终体积减少到5-10ml。
接受2-6天高剂量化疗或辅以全身放疗，这种治疗可以破坏癌细胞，破坏原有的免疫系统，使新移植入的骨髓不受排斥。末次化疗后36-72小时开始移植，从骨髓采集的干细胞或从外周血分离的干细胞输入病人的静脉。虽然在贮存前经过预处理，干细胞中依然含有少量红细胞，所以显现红色。移植治疗的付作用包括：移植以后数小时病人可能出现发热，寒战，过敏反应，心动过缓，低血压，头晕，呕吐，腹泻等症状。
（吕占军 王秀芳）
参考文献
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