第十一章 肿瘤治疗
可以预言在今后相当长的时期内，恶性肿瘤仍是威胁人类健康和导致死亡的主要原因之一。据世界卫生组织估计，全世界每年约有635万人死于恶性肿瘤，相当于每5-6秒钟死亡1人。由于恶性肿瘤的治疗效果较差，许多恶性肿瘤目前尚缺乏根治性的治疗方法。在临床上被确诊为某一种恶性肿瘤时，最关心和最迫切需要知道的是，这个患者应当选择什么样的治疗方法，在名目繁多的治疗方法中，到底那种方法最好，能使患者所患的肿瘤尽快治愈，高质量的生存更长时间。虽然恶性肿瘤的治疗效果较差，但是患有同样一种恶性肿瘤的病人其治疗的效果、生存的时间可以相差甚远。这些现象，一方面说明了恶性肿瘤治疗的复杂性，另一方面也向人们展示了恶性肿瘤治疗和预后的光明前途。
临床及肿瘤病因学的基础研究表明，对肿瘤的治疗不能仅满足于专科局部的治疗方法，而应当从全身入手，采用多样治疗方法共同和交替使用的立体性综合方法。肿瘤治疗是一个系统工程，临床医学虽然分科精细，但是有关肿瘤治疗方面的知识是各科医生都应当学习和掌握的。大部分肿瘤如能早期确诊，则外科手术治疗当属首选疗法，但如发现较晚，则必须同时进行放射和药物治疗。所以在当前临床治疗研究中对各种治疗方法本身的改进，以及各种方法之间科学和合理的综合应用，仍占有主要地位。近年来有一些新的治疗方法正在兴起，而且逐渐加入到肿瘤综合性治疗的行列中来，其中包括免疫治疗，中药治疗，基因治疗和物理疗法。
一、肿瘤的免疫治疗
近10多年来关于肿瘤免疫疗法的研究和临床应用报道甚多。尤其是1983年Oldhamr提出生物反应调节剂（biological response modifier, BRM）治疗以来，大量应用细胞或细胞产物调节免疫功能治疗肿瘤，以及最新提出基因治疗等方法，有新的发展和突破。然而各种研究并不令人满意。肿瘤的免疫治疗涉及两方面：1、肿瘤细胞表面抗原，即肿瘤抗原性；2、患者的特异性免疫应答。关于肿瘤抗原，一般认为：化学物质诱发的肿瘤有肿瘤特异性抗原，但是相同化学物质诱发的不同肿瘤，肿瘤特异性抗原可以不同，甚至在同一个体不同部位诱发的两个肿瘤间，肿瘤特异性抗原也不相同（图11.1)；相同病毒在不同个体诱发的肿瘤有共同的肿瘤特异性抗原，但是又有各自的肿瘤特异性抗原（图11.2）。肿瘤之间特异性抗原的差异给肿瘤特异性免疫治疗带来了困难，例如不能使用有针对性的疫苗来预防肿瘤发生。
化学致癌剂
病毒 图11.2 病毒诱发的肿瘤抗原 病毒诱发的肿瘤有共同的肿瘤特异性抗原，又有各自独有的肿瘤特异性抗原
（一）重组细胞因子
细胞因子是一大类调节细胞功能的蛋白质，它是一类化学信使，以自分泌方式作用于分泌它们的细胞，或以旁分泌方式作用于附近细胞，它首先和细胞表面的受体结合，然后把信号传递到细胞核，触发一些基因转录，或者抑制另一些基因转录，最终改变了细胞中蛋白质合成的模式。细胞因子参与免疫反应，通过机制包括：1）直接抑制肿瘤的生长或分化；2）直接细胞毒作用；3）刺激宿主防御细胞；4）切断肿瘤营养供给。目前所知的细胞因子有：干扰素（IFN-α、β、γ）、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF-α、β)、淋巴毒素(LT、TNF-β）、集落刺激因子(GM-CSF、G--CSF、Multi-CSF、M-CSF)、转化生长因子(TGF)。这些生长因子在介导机体多种免疫反应中，发挥重要作用。
（二）过继细胞免疫疗法
把具有抗癌活性的免疫细胞在体外培养并激活后，回输给荷瘤者，称过继细胞免疫疗法。自1985年Rosenberg等采用IL-2激活的淋巴细胞，即LAK细胞治疗肿瘤以来，相继对LAK、CTL、TIL的实验和临床治疗进行了深入研究，目前治疗肿瘤的免疫活性细胞有：
1、细胞因子激活的杀伤细胞（LAK)） 研究发现，血或脾淋巴细胞大部分LAK活性，就是由于IL-2刺激了NK细胞生长和表现细胞毒作用。NK细胞与LAK的主要区别在于LAK细胞能溶解所谓NK抵抗性靶细胞（如新鲜分离的肿瘤细胞），其生长和功能依赖于IL-2，故单独给予LAK细胞效果极差，必须与大量的IL-2联合应用，其作用不受MHC限制，故无特异性。
2、肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL） 1986年Rosenbery发现从实体瘤组织中分离到的TIL，在体外经IL-2 激活后，可大量扩增，并对肿瘤细胞具有高度杀伤活性，其体外抗肿瘤效果优于LAK细胞50-100倍，并仅需小剂量的IL-2就可以发挥明显的抗肿瘤效果，而且副作用低。TIL受MHC限制，故对肿瘤细胞有识别能力，具有特异性杀伤力。TIL比LAK细胞更适合于肿瘤过继免疫治疗。一般认为疗效主要决定于TIL杀伤自体肿瘤的细胞毒性及所输入TIL达到肿瘤的数量。Kradin等首次给14例晚期癌症患者联合应用TIL和IL-2，发现4例（28%）瘤体积缩小50%以上。新兴的基因治疗对TIL疗法的影响，集中在两方面：一是改造肿瘤，使之成为TIL局部免疫细胞的靶子，二是改善TIL性能，将细胞因子基因导入肿瘤，将为TIL治疗开辟良好前景。
（三）单克隆抗体
杂交瘤技术的发现，用抗肿瘤相关抗原的鼠单克隆抗体治疗相应肿瘤的报道增多。这些报道已从单纯地用单克隆抗体，逐步发展到抗体改建后综合治疗和抗体为载体的导向治疗，疗效得以提高。单抗抗肿瘤的机制不明，有人认为它通过抗体依赖的细胞毒作用，介导单核细胞杀伤肿瘤，也有人认为单抗具有抑制肿瘤细胞的特殊功能，如超氧离子的产生和溶酶体酶的释放。另外，单抗与肿瘤细胞表面结构如生长因子或受体结合，干扰细胞的生长和分化，用单抗做被动免疫治疗肿瘤的报道甚多，然而效果不甚满意，主要原因是因为单抗不能直接活化人补体并且在肿瘤中的分布甚少。单抗和细胞因子（如IL-2和r-TNF）联合应用，可以提高疗效。对造血器官肿瘤或其它肿瘤骨髓浸润，用单抗加补体，磁珠（结合抗肿瘤细胞抗体的磁性小珠）或浮珠进行骨髓体外净化，去除肿瘤细胞，并对患者采取放疗和（或）大剂量化疗，再回输净化的自身骨髓细胞，这种方法已广泛采用。近年来，经单抗为载体的导向治疗，是另一治疗肿瘤的途径，如抗肿瘤单抗与放射性核素、抗癌药和毒素偶联，肝动脉灌注131I抗人肝癌单抗，治疗肝癌用于临床，部分病例可使肿瘤缩小，以争取手术。
（四）其它
肿瘤免疫治疗已经积累了丰富的资料，主动免疫中有活疫苗，死疫苗，自身疫苗，化学修饰疫苗，基因工程疫苗等。非特异免疫治疗中有卡介苗，短小棒状杆菌，细菌成分等。
二、肿瘤免疫研究进展 ── 肿瘤配型抗原研究*
（一）肿瘤抗原研究回顾
尽管提出肿瘤抗原的设想已经100多年了，但用实验证实肿瘤抗原的存在还是近几十年的事。1957年前后，Gross、Foley等多位学者用甲基胆蒽诱导小鼠肿瘤，诱导的小鼠肿瘤可在同系小鼠中移植，但事先用灭活的瘤组织免疫小鼠则移植的肿瘤不能存活，这种瘤组织的免疫不影响正常皮肤移植物的存活，这就排除了正常移植抗原的影响。许多实验室在小鼠、大鼠、豚鼠也都证明有肿瘤特异性抗原存在。
人类自发性肿瘤抗原性比较早期的工作是间接的，如3月龄尸检肾上腺神经母细胞瘤发生率为1:220，临床实际发病为1:10,000；瘤组织有巨噬细胞，淋巴细胞浸润预后好；肺癌自体移值104个细胞不能生长，但是自体移植108细胞可以生长；癌症恢复期血清中有抗癌细胞的抗体。
自从80年代单抗技术发展起来以后，已用单抗的方法确证人类肿瘤细胞存在肿瘤特异性抗原，这些特异性抗原可能是在癌细胞突变过程中出现的新抗原：如Ras基因点突变导致胰腺癌，也可能是病毒原性的，如宫颈癌（人类乳头状病毒），鼻咽癌(EBV）。将细菌超抗原与Meth A肿瘤细胞偶联后免疫小鼠，使小鼠获得强的抗肿瘤能力。合成105个氨基酸的黏液素肽，该多肽有5个重复的表位可以激发免疫应答，将该种多肽与卡介苗混合接种于腺癌病人，7/22的病人黏液素特异性细胞毒淋巴细胞上升2-4倍。
检测肿瘤组织和同一个体瘤周组织的抗原性，显示有许多差异，有些抗原性上升，有些抗原性下降。这样如分析肿瘤细胞与同源正常细胞的抗原性，就会发现一组区别。习惯上将肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，前者指仅存在于肿瘤细胞，其性质与正常组织所表达的抗原有区别，互相间不发生交叉反应的抗原；后者指肿瘤细胞中含量高，但非肿瘤细胞所特有，正常组织中也可以少量存在的抗原。肿瘤细胞中也会有许多抗原性减少或缺失，如MHC抗原，黏附分子等，这些抗原在肿瘤逃避免疫监视方面，及对于了解肿瘤的生物学行为可能至关重要。
（二）免疫诊断与治疗评价
早期的研究工作已经证明理化因素诱发的动物肿瘤有肿瘤特异性抗原，但是不同的肿瘤特异性抗原不同，病毒诱发的肿瘤有共同的该病毒肿瘤特异性抗原和各自的肿瘤特异性抗原。
从理论上讲，肿瘤细胞具有抗原性并能引起机体免疫应答，肿瘤的免疫诊断与治疗具有充分的依据。许多学者多年来试图找到一些特异的肿瘤共同抗原，但实践却说明似乎这种抗原并不存在。他们所希望的一些用于检测肿瘤的单抗除去特异性不强，可以与多种类型的肿瘤反应外，甚至可以和非肿瘤细胞及正常组织反应。
已积累了许多的资料研究肿瘤细胞抗原性与肿瘤生物学行为的关系。Ki-67，PCNA抗原在肾癌等可以作为评价预后的指标，在某些妇科癌患者所有癌细胞Ki-67弥散着染意味着预后差，在Ki-67局灶性着染患者中，MIB-1染色弱者预后优于染色强者。
由于人类肿瘤是由自发的、理化因素或病毒诱发的等所组成，这与在实验动物的实验性肿瘤相比较更为复杂。主动免疫治疗多采用同种异体或自身肿瘤组织作为抗原。对于十分复杂的抗原性，如不加以区别，随机选用，所选抗原合适的机会是较少。在尚不能了解肿瘤抗原性的情况下，应选用自身瘤苗，一旦激发免疫应答，对肿瘤组织会有一定的针对性。
转移因子、免疫RNA两种制剂都有特异性，在不考虑肿瘤细胞特异性不同情况下，制出的转移因子和免疫RNA与同种异体肿瘤的主动免疫一样都缺乏针对性。被动免疫疗法除免疫毒素外，对被动给予抗体治疗肿瘤多持否定态度。
（三）肿瘤配型抗原研究
1、肿瘤配型抗原概念 无论人还是动物肿瘤，不同个体的肿瘤可以表现不同的生物学行为包括治疗学行为。根据大量实验和观察，作者认为有一组抗原决定肿瘤的生物学行为，肿瘤细胞生物学行为改变一般均涉及生物大分子质和量的改变,大分子往往具有抗原性,可以通过免疫学方法检测，据此提出“肿瘤配型抗原”概念及其研究，通过分析肿瘤细胞抗原性的变化,从分子水平确定肿瘤的生物学行为,指导临床,选择最佳治疗药物或方案。
本文对肿瘤配型抗原的定义如下：
肿瘤配型抗原是决定肿瘤生物学行为的抗原。在实际研究中将肿瘤组织改变、添加或缺失的抗原及与该种抗原有交叉反应的抗原都列为肿瘤配型抗原。
肿瘤配型抗原是一个更广泛的定义，包括了肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原，肿瘤缺失或减少的抗原，某些决定簇改变的抗原，以及与肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原有交叉反应的抗原。
肿瘤配型抗原强调肿瘤的个体性和与肿瘤生物学特征的联系，某种抗原只要在一部分肿瘤能反应其生物学行为，即认为为肿瘤配型抗原，尽管该抗原可能在其它肿瘤不能反应生物学行为甚或在正常组织也存在。
肿瘤配型抗原研究是对症治疗疾病这一概念在分子水平的延伸。首先确定肿瘤细胞的抗原性（蛋白质分子组成）与同源正常组织的差异，及与不同肿瘤组织之间的区别，然后了解这些结构的生物学意义及其代表何种治疗学反应性。将以往近乎盲目的肿瘤治疗方案建立在实验科学的基础上。实际上目前已经积累了相当多抗原性与肿瘤行为关系的资料，如p53，CD34，ER，PR等，因此作者认为有必要象对待细胞分化抗原（CD antigen）一样，提出专门反应肿瘤行为特征抗原的名词，这样有利于研究、比较和归纳、总结资料。
2、配型抗原检测 在实验中我们选用ELISA和免疫组织化学方法检测肿瘤细胞上发生变化的生物大分子，来预测肿瘤生物学行为，购买部分已知单抗和自制了145株单抗。利用这些检测单抗，并借助免疫组织化学和彩色图像分析系统，对临床病人肿瘤进行检测分析。通过检测卵巢癌和贲门癌结果发现，这些检测单抗中，只有部分单抗能够反应某种肿瘤特定的生物学特性；能够预测贲门癌预后的单抗对于卵巢癌并不适用；并发现必需通过多参数（多种检测单抗）分析肿瘤的抗原性，才能准确的推导其生物学特性。单参数分析在群体水平有意义，多参数分析在个体水平有意义。肿瘤配型抗原检测的结果，可预示肿瘤患者是否适应放疗、化疗、免疫治疗和推导预后等。
3、肿瘤配型抗原治疗 理想的方法是：确定肿瘤有何种肿瘤特异性抗原，然后选用与其有交叉反应的抗原做主动免疫治疗。以下几点说明肿瘤特异性抗原在不同肿瘤可以不同，但是也可能相同。不同时无交叉保护作用，相同时有交叉保护作用。
（1）动物实验 病毒诱发的肿瘤有共同的肿瘤特异性排斥抗原，有时不同的RNA病毒（友V，猴V，GraffiV等）诱导的肿瘤也有共同的排斥抗原。
Reiner等人证明有的小鼠肉瘤（化学物质诱导）在用另外的肿瘤免疫时也有保护作用，而且保护作用更强。提示肿瘤排斥抗原有交叉反应或有共同抗原。
细菌凝集素受体免疫小鼠推迟MCA(3-methylcholanthrene)诱导肿瘤的生长，也提示该受体与肿瘤有共同抗原。有时数种肿瘤组织混合后免疫小鼠可防止另外肿瘤的生长。
（2）人类肿瘤 已鉴定出６种黑色素瘤的肿瘤特异性抗原，98％的黑色素瘤至少含这６种抗原中的一种，所以有人提出应该使用混合多价疫苗主动免疫治疗黑瘤病人。病人体内的肿瘤细胞有不同于正常组织的成份那免疫系统为什么不能将其排斥呢？经研究表明，免疫系统的抗肿瘤作用需要抗原递呈细胞的联合作用，该种联合刺激不完善是导致肿瘤不被排斥的原因。
膀胱癌患者的膀胱冲洗淋巴细胞与外周血淋巴细胞显著不同，BCG（卡介苗）免疫患者的膀胱冲洗淋巴细胞为寡克隆（说明出现免疫反应），BCG与肿瘤细胞的热休克蛋白有交叉反应，热休克蛋白在某些肿瘤细胞高度表达，这可以解释BCG治疗肿瘤的有效性。
（3）本实验室的工作 本室的实验己制备出145株抗癌组织的单抗，其中有些株具有癌组织特异性，例如，W1E2抗原存在于30%的癌组织中，S3E1存在于20%的癌组织中。我们的实验也说明肿瘤存在不同于其正常组织的抗原性，并且这种抗原性互不相同，但是随着样品的增大将出现重复。
4、配型原则
（1）多参数检测分析病人肿瘤细胞抗原性特征；
（2）根据检测结果推导肿瘤的生物学行为和在治疗学上的意义；
（3）如果发现肿瘤组织有特异性肿瘤抗原，可以选择与该抗原有交叉反应抗原作为免疫治疗剂。
5、肿瘤免疫的困难 免疫学理论与技术用于肿瘤学研究已有近百年的历史，对肿瘤诊断与治疗取得了一定的进展，但是仍存在许多问题:。
（1）大部分患者的肿瘤抗原性很弱。
（2）.突变基因不一定改变抗原性，而成为有效的免疫靶。我们的实验也说明，并非所有的患者都适应于免疫治疗。
（3）肿瘤细胞存在异质性，对于肿瘤细胞，肿瘤的发生是获得了生长优势，但肿瘤细胞竞争的对手是机体的正常细胞，随着机体正常功能的减退，肿瘤细胞则失去生存的基础，每株肿瘤细胞就相当于进化中的一个新种，不过它将随着机体的灭亡而灭亡。所以不同的肿瘤细胞都有自己不同的生物学特性，使得对肿瘤的生物学行为的检测和预示十分困难。
用一种或少数几种单抗或肿瘤标志物，不可能检测所有肿瘤的性质，多参数分析则可准确预示不同肿瘤的生物学性质。这也是提出肿瘤配型抗原研究的原因。
三、肿瘤的中药治疗
中医认为肿瘤是一类涉及整体的全身疾病。早在2000年以前，祖国医学对肿瘤就有记载。几十年来，我国对肿瘤的中医治疗进行了大量的科学研究，包括按抗癌化疗药的方法进行了中药的抗癌筛选，并开展了对辨证论治的实验探索。虽然中医的理论基础和应用的药物与西医有巨大的不同，但临床实践业已证明，中药在肿瘤治疗上确有相当的疗效，在某些方面可以弥补西医的不足。
（一）肿瘤中医治疗的理论基础
从中医观点看，癌肿的形成与发展是正邪矛盾双方面交争发展变化的过程。一是体内正气相对虚弱，二是邪气对人体的影响，引起人体阴阳平衡失调、脏腑升降功能紊乱、气血运行不畅，造成气滞血淤、痰凝湿聚、邪毒郁热等一系列的病理变化，最终酿成肿瘤。治疗肿瘤就是要扶助正气，祛除邪气，改变邪正双方力量的对比，使之有利于疾病向痊愈方面转化，所以扶正祛邪是指导肿瘤临床的一条重要治疗法则。在扶正当中，中医又特别重视脾肾两脏，脾为后天之本，气血生化之源；肾为先天之本，真阴真阳所藏之处。若脾肾不固，先天后天失调，就易致癌瘤发生，因此恶性肿瘤患者大多数有脾虚、肾虚等症状，其细胞免疫功能也较正常人低，通过中药建脾补肾，均能提高机体的细胞免疫功能和调整内分泌失调状态，使正气得以恢复，抗癌能力得以增强，肿瘤病人经手术、放射治疗、化学治疗后损伤正气，正衰而邪盛，机体抗癌能力低下，往往使癌瘤进一步播散扩展，这是晚期癌瘤的一大难题，故采用扶正与祛邪相结合，调整脏腑气血阴阳，补益先天和后天功能，增强和调动机体本身抗癌能力是当前恶性肿瘤治疗中发展起来的最常用的法则，对治疗癌瘤带病延年有着十分重要的意义。肿瘤发病较复杂，往往虚实相兼、寒热交错，多组织器官受累，因此如何从整体观念来认识肿瘤，用辨证论治的方法来治疗肿瘤，这也是中医临证的精华所在。
（二）肿瘤的中医治疗
肿瘤临床应用中医药十分普遍。据大量的临床报道，中医中药的应用，在一定程度上可稳定或缩小肿瘤，改善症状，提高生活质量，延长生存期等效果。抗癌中药组方大致可分为3个内容，即辨证用药、抗癌用药和对症用药。
1、辨证用药 按中医理论辨别患者属虚证、实证或虚实夹杂；判断病邪的部位和性质，根据不同的辨证，相应用药。
凡是阴阳、气血虚弱，则用滋阴助阳、补血益气的药物；气滞就用理气药；是血淤，即用活血化瘀药；是热毒，即用清热解毒。活血化瘀、益气养血、养阴生津、化痰软坚、理气散结、滋阴补肾、健脾化湿、温肾助阴、利水渗湿、消肿止痛等辨证施治方法治疗肿瘤。这些治法，是运用补偏救弊、扶正祛邪等辨证观来调整机体因癌肿所造成的损害和紊乱而达到治疗肿瘤的目的。其作用机制有的是通过清热解毒消除炎症，从而达到减轻症状，有的是通过益气养血提高机体免疫能力，有利于抑制癌细胞的生长和发展；有的通过活血化瘀，理气散结，达到破除积聚（消除肿瘤），有的通过滋阴补肾或温肾补阳，平衡阴阳，恢复脏腑功能，改善症状等。
2、抗癌用药 这些中药是根据中医传统方剂，民间验方收集，经药理实验筛选证明确有一定的抗癌作用。所以，在中药组方中，在辨证用药的基础上，根据不同的肿瘤常用一些有抗癌作用的中草药。
常用的中草药，按其中药药性可分以下几类：
清热解毒类：如山豆根、风尾草、半枝莲、白花蛇舌草、白英、蛇毒、紫草等。
活血化瘀类：如山慈菇、冰球子、夏枯草、海浮石、石燕、海带、海藻之类。
化痰类：如象贝、皂角、天南星、半夏等。
其它类：如马钱子、威灵仙、鸦胆子、雄黄、蟾蜍、木瓜、望江南、防己、白术等。
3、对症用药 癌肿者常有多种症状，如咳嗽、恶心、呕吐、黄疸、腹水、疼痛以及各个部位出血等。在用药时，除辨证用药、抗癌用药，还同时加入对症用药，以尽快减轻症状。
食欲不振：常用神曲、炒麦芽、焦山楂等。
恶心：常用佛手、藿香、佩兰、苏梗。
呕吐：常用生姜、半夏、陈皮等。
腹水：常用茯苓、车前子、大暖皮、虫笋之类。
咳嗽：常用麻黄、杏仁、桔梗、冬瓜子、川贝等。
疼痛：常用生蒲黄、五灵脂、延胡等。
出血：鼻血常用白茅花、仙鹤草等。
四、肿瘤的基因治疗
基因治疗主要包括以下四个方面：靶细胞的选择，将目的基因导入靶细胞的基因转移方法，目的基因的正常表达，目的基因的选择和应用。肿瘤基因，特别是有关癌基因、抑癌基因的研究，使人们对肿瘤的认识进入了一个新的领域。1980年Cline将小鼠细胞DNA转至骨髓细胞，然后将该骨髓细胞移植给经全身照射后小鼠，使基因得到表达，成为基因治疗的先导。基因治疗的经典概念系指通过外源基因导入人体以纠正内在的基因缺陷的疗法。肿瘤基因治疗不再局限于“纠正基因缺陷”，系指将外源的正常基因导入人体，达到直接或间接抑制或杀伤肿瘤细胞的目的。这已超越了经典概念，这一概念亦同样适用于治疗某些传染病（如AIDS)、心血管病及代谢病等。但是由于目前可供选择的目的基因的局限，基因导入技术尚不完善，以及基因导入后表达和调控尚存在不少难题，因此，基因治疗是一种不成熟的、发展中的生物治疗方法。预计在本世纪，基因治疗肿瘤将会成为一种生物治疗常规方法，将成为手术、化疗、放疗的补充治疗手段。
（一）基因转移及导入技术
基因转移及导入技术有多种形式，包括物理、化学及生物学方法（表11.1）。直接能用于人体的基因转移技术，则以生物学方法为主。化学方法可用于局部注射，如应用脂质体及其类似物与DNA形成的复合物等。各种方法的优缺点及应用范围见表11.2。
表11.1 基因转移和导入技术
导入方式 导入技术 应用
物理方式 基因枪 离体
电穿孔 离体
微注射 离体
DNA转染 离体
化学方式 人工脂质体 离体及体内
Lipofection 离体
Cytofection 离体及体内
生物学方式
DNA与配体偶联 离体及体内
病毒载体 离体及体内
表11.2 各种基因导入技术的优缺点
应用 物理 化学 生物学
体内治疗 不宜 限于局部
局部或系统给药
靶向的特异性 无 无 部分
有效程度 低,中度 低,中度 高,中度
基因表达作用 无促进 无促进 病毒表达有促进
（二）基因治疗的载体系统
基因治疗的载体系统分为病毒载体及非病毒载体系统两类。病毒载体使用的病毒有：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及疱疹病毒等。病毒载体是将病毒基因改建，去除其部分甚至大部分基因，将外源基因插入，并由能表达该病毒部分蛋白（外壳、核壳蛋白及聚合酶）的细胞（包装细胞）组装成假病毒。这种假病毒虽具有部分原来病毒特点，但已失去复制能力，而将外源基因导入细胞，其导入基因的效率将高于一般化学方法，而且较少降解。其中逆转录病毒介导基因，不论在体内或体外，被认为是最成功的载体。它对于具有分裂功能的细胞基因的转移和表达带有持续性和靶向性。目前使用该载体进行人体基因治疗已达百余例，主要是遗传病的治疗。
重组腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、EB病毒载体和细小病毒载体对分裂后细胞基因转移比较成功。由于逆转录病毒载体只能将小片段基因转入分裂细胞，而腺病毒能感染多种静止期细胞，尤其是呼吸道上皮细胞，其基因携带量比逆转录病毒也大很多，且腺病毒并不插入受体细胞的基因组，以染色体外形式长期存在和表达，安全性明显高于逆转录病毒，所以腺病毒在基因治疗中的应用倍受重视。此外，作为一类可用于治疗神经系统疾病的单纯疱疹病毒（HSV）载体，可直接体内应用的痘苗病毒（VV）载体也有较好应用前景。
非病毒载体包括脂质体-质粒DNA复合物、DNA-多聚赖氨酸复合物、细胞受体等。这些载体可免除病毒载体的安全性问题，但导入效率一般不高，必须经过筛选后才能扩增。有人对DNA-脂质体的体内安全性做了系统研究，静脉注射，认为毒性很低，直接导入肿瘤组织，可有一定量的摄取，一部分将被溶酶体酶降解，因此，有多少完整的基因能在细胞中继续表达尚存在问题。DNA-多聚赖氨酸复合物的优缺点是可连接某些配基，具有定向性，吞入细胞后，DNA可进入核内，可得到稳定或短暂表达，缺点是易被溶酶体的酶所降解。DNA-脂质体本身可直接注入动物骨骼肌而获表达，肌肉为唯一一类溶酶体系很低的细胞，DNA注入后能存留，而且外源基因将存在于染色体外而无整合，可持续表达十几个月。如果这一技术能达到使用的程度，无疑是对基因治疗的一个重大推进。现将各种特定靶组织与基因转移的方式和途径归纳于表11.3。
表11.3 特定组织细胞的基因转移方法和途径
特定组织细胞 基因转移方法和途径
淋巴细胞
逆转录病毒、基因枪、电穿孔
肺组织 腺病毒、脂质体
骨骼肌肉组织 基因枪、DNA直接注射
脑组织 单纯疱疹病毒
肝组织 门静脉直接注射、基因枪等
乳腺组织
逆转录病毒
皮肤组织
电穿孔、基因枪
动脉管壁组织 逆转录病毒、脂质体等
（三）肿瘤基因治疗的临床应用研究
目前绝大多数基因治疗方案采用“离体”治疗，大致过程为：将患者的某种组织或细胞（如成纤维细胞、骨髓、肝、外周血干细胞、甚至肿瘤细胞）取出体外，在短期培养的条件下转入目的基因，还可进行筛选和富集含有外源基因的细胞，然后再回输患者体内。恶性肿瘤基因治疗方法大体有以下几种：
1、细胞因子基因治疗 这是目前研究项目最多的一类，1991年美国RAC在人类医疗史上首次批准进行了一次TNF-α基因治疗计划，从晚期黑色素细胞瘤患者瘤体内分离出TIL细胞，转染克隆有TNF-α基因逆转录病毒载体，再回输给患者体内，期望TIL所表达分泌的TNF-α能增强其杀瘤作用，然而结果不满意。同年10月，研究小组再次将TNF-α和IL-2基因导入恶性黑色素瘤患者瘤细胞中，经放射处理，去除其增殖能力后，再输回患者体内，进而杀伤体内其它部位肿瘤。Gansbacher等人将克隆有人IL-2-cDNA基因的病毒载体转染小鼠肿瘤细胞，输入小鼠体内后，这些肿瘤细胞除了自身失去体内成瘤能力，还抑制了体内野生型肿瘤细胞的生长。
目前已有数种细胞因子被用于这一研究，例：IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、TNF、GM-CSF和IFN等。这些细胞因子的生理作用方式是局限性的，因此，设想将细胞因子输入肿瘤细胞，在肿瘤局部分泌较高浓度的细胞因子，刺激机体产生抗肿瘤免疫反应，细胞因子基因输入肿瘤细胞后，细胞因子的表达通常不影响肿瘤细胞在体外培养液的生长活力，但将用细胞因子基因修饰的肿瘤细胞接种入同种鼠时，可导致肿瘤完全消退，动物实验的结果引起了广泛的争论。表达细胞因子的人体肿瘤细胞经放射线照射后，分泌细胞因子的能力不受影响，细胞可存活两周左右，因此可将表达细胞因子的肿瘤细胞作为疫苗接种于患者体内，以刺激机体产生抗肿瘤免疫反应。用细胞因子基因转染抗瘤免疫效应细胞如TIL、CTL细胞可以增加抗癌性。
2、导入MHC基因 肿瘤细胞上的MHC-1类抗原表达减少，导致T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤减弱。实验证明：通过基因转染可使肿瘤细胞MHC-1类抗原增加，从而降低小鼠肿瘤细胞的致瘤能力，肿瘤致瘤能力降低被认为是肿瘤细胞上肿瘤特异性多肽表达增多，从而引起体内CD8+T细胞对肿瘤的排斥。这些研究尽管获得一些积极性进展，然而MHC分子表达程度与肿瘤细胞的致瘤性的关系，在不同的动物模型中表现不同，增加MHC分子的表达，并不总能增加肿瘤细胞的免疫原性。目前，此类研究用于临床尚少，其价值有待于进一步研究评价。
3、以抑癌基因作为目的基因的基因治疗方法 目的基因即弥补缺损基因及纠正异常基因的外源性正常基因序列，包括标志基因（marker genes)、反义结构基因、免疫刺激性细胞因子基因、病毒酶类基因、药物抗性基因、组织相容性复合体基因等。这些基因无论整合染色体还是游离细胞浆中皆能稳定地随细胞分裂而复制。
以抑癌基因作为目的基因的基因治疗方法，也称替代疗法，就是恢复由于缺失或突变而失去的抑癌基因的正常功能。包括基因添加和基因置换两种方法。研究较多的是基因添加，即追加正常基因以弥补细胞的功能缺陷，这种方法的优点是运用基因工程，使原本不表达的某基因或表达失活的细胞，转为正常表达；基因置换即利用同源重组的方法将外源正常的抑癌基因导入靶细胞，取代突变或缺失的抑癌基因，以达到彻底修复受损细胞、逆转恶性表型的作用。70年代初，knudson在研究儿童视网膜神经母细胞瘤基础上提出了癌变的两阶段突变假说。1986年Friend 等发现定位于13g14的Rb基因。这一系列工作提示肿瘤发生过程中有一种通过纯合缺失或失活而引起恶性转化的基因。作为抑癌基因应该符合三点：1）肿瘤相应正常组织中这种基因必须表达正常；2）恶性肿瘤中这种基因必须有所缺失或突变；3）野生型抑癌基因导入恶性肿瘤细胞内可部分或全部改变其恶性表现。其作用是：1）抑制细胞增殖或转移；2）促进细胞分化；3）诱导细胞调亡。
4、药物敏感性基因的选择及在肿瘤基因治疗中的作用 细菌和真菌能产生胞嘧啶脱氧氨酶（CD），CD能催化5-氟胞嘧啶（5-FCYT）转化为5-氟尿嘧啶（5-FU），后者为具有高度的细胞毒性的化疗药物，能抑制RNA和DNA的合成而致细胞死亡。Austin在结肠癌肝转移患者中采用了这一治疗方案。在原发和转移的结肠癌细胞中，CEA