第八章 RNA群基因启动模型
摘要 本书第七章中作者提出了一种新的衰老学说——“基因阻遏平衡论”，解释衰老和分化，认为：上级基因启动下级基因，然后上级基因阻遏，这是衰老和分化的本质原因。在本章中，作者提供实验证据证明，上级基因启动下级基因的特异性物质是RNA，并提出RNA群基因启动模型，该模型与基因阻遏平衡论一起，解释真核细胞中的基因启动、表达事件，也同时说明衰老、分化和肿瘤发生。认为：真核细胞中基因启动需要经过两级调控，第一级调控由RNA引起，使特定区段染色质具备疏松潜能；第二级调控主要由序列特异和非特异蛋白质控制，使RNA作用区段的基因疏松、转录。真核细胞中所有表达基因产生的RNA，剪切为小片段，其中主要为内含子RNA，混合在一起形成RNA群（所以称为“RNA群基因启动模型”），每种RNA小片段及其同源顺序作为一组形成一定的摩尔浓度（重复顺序起作用更大），特定细胞中有许多组RNA小片段，不同分化细胞中RNA小片段的种类不同。在DNA复制后尚未包装成核小体前，核液中的RNA与DNA双链中的一条DNA链竞争结合，则使该区域不能包装成典型核小体。DNA复制结束，分裂为新的细胞后，这些非典型核小体区域即在非组蛋白作用下形成疏松区域。表达区域都疏松，但疏松区域不一定都表达，可能基因全顺序疏松，包括5'、3'端非转录区加上必要的转录因子是基因转录的必要条件。细胞每分裂一次都要经历上述基因转录RNA，然后RNA识别、印记基因的过程。不同细胞中的RNA群不同，所以对基因的印记不同，这是不同细胞中基因表达不同的主要原因。呈疏松状态的基因类似于细菌的操纵子系统，细胞环境的诱导使不同基因表达，产生不同的RNA，形成不同的RNA群，在DNA复制时印记不同的基因区段，这是分化的主要原因。某种基因印记产生的RNA群不能再形成完全相同的该种基因印记，否则会成为永生细胞，所以该过程也控制衰老和肿瘤发生。
一、导言
胚胎发生过程中所以能相继出现新类型细胞是由于特定基因活化的结果。通过特定基因的表达合成某些特异性蛋白质，执行特殊功能，但在胚胎发生过程中细胞分化与基因表达存在何种具体关系还不完全清楚。在多细胞生物的特定分化细胞中，只有少数基因（10%）能够转录mRNA，不同类型的分化细胞所转录mRNA的类型可能相同，可能不同。在细胞中处于转录状态的基因称为活性基因，活性基因位于常染色质部分，在光镜及电镜下呈疏松状态。活性基因具有对DNase I（胰DNA酶）的敏感性，鸡输卵管细胞卵白蛋白基因处于活性状态，Garel A.等证明DNase I优先消化鸡输卵管细胞核的卵白蛋白基因，DNase I处理肝细胞核时无此选择性消化作用。衰老时DNA的DNase I 抗性上升，所检测老年大鼠的6种器官（心、肝、脾、肺、肾及脑）组织细胞核及染色质对DNase I的消化敏感性均较断奶乳鼠相应的组织低。说明基因活性的改变与分化和衰老有关。
基因特异性转录的出现和维持如何发生尚无最后定论，已提出若干学说，可以归纳为蛋白质调控，RNA调控，构像调控等观点，每种观点都有支持的依据，也有不能解释的现象。Britten-Davidson最早提出RNA可以调节基因表达，以后又有所发展，根据本研究提供的证据及参考其它资料，作者认为Britten-Davidson基因启动模型比较合理，但是需要补充。
一般认为衰老和分化是由于基因表达改变的结果，那么本研究中心要解决的问题是：为什么相同的基因在不同的细胞中表达不同。
二、存在的问题
当前生物学及医学领域存在许多不能很好解释的问题，见本书第二章。在此再强调几点：
1、如果说蛋白质调控特异性基因表达，那么蛋白质调控明显存在顺序识别特异性不够的问题，基因表达有很好的细胞特异性，要从众多的基因中识别出特定的基因要求激活物与基因有高度的特异性亲和性和广泛的结合位置。而蛋白质与基因的亲合性一般不高，对基因的结合部位不够广泛。
2、蛋白质本身也是基因表达的产物，转录因子多属于蛋白质，所以会出现什么成分调控转录因子的问题，即转录因子的转录因子如何调控。
3、顺序特异性蛋白质是大分子（大分子与配基的结合速度较慢），在细胞核内含量稀少。运动速度慢，含量少的蛋白质分子要在几分钟内识别出特异的基因顺序从原理上讲应该有困难。
4、内含子的作用。
5、重复顺序的作用。
6、细胞分化状态的维持。
7、为什么不转录的基因对DNase I也可以敏感，如无激素刺激的鸡输卵管上皮细胞不合成卵白蛋白，但是卵白蛋白基因对DNase I 依然敏感，有时细胞的基因DNase I 消化敏感性一旦形成，会维持许多细胞代。
8、真核细胞的DNA为什么要与组蛋白、非组蛋白和RNA形成复合物。
9、“基因阻遏平衡论”（见第七章）在解释衰老、分化和肿瘤方面有明显的优势，但是上级基因靠什么启动下级基因。
这些问题都需要给予回答。
三、RNA启动基因的证据
（一）外源RNA对基因表达的影响
RNA的基因调节作用早已为人们所关注，有如下证据表明外源RNA激活基因表达。
1、早在1961年，我国学者牛满江等就用牛肝RNA使Nelson腹水癌的移植率明显下降，并诱导合成血清白蛋白；
2、进一步有人证明肝癌细胞经鼠肝RNA作用后，白蛋白合成显著增加，这种作用可由肝RNA介导，而其它组织来源的RNA无效。
3、鲤鱼表现单尾，金鱼表现双尾，鲤鱼卵RNA注射入金鱼卵以后，孵化出的金鱼单尾者增加。
4、有人用外源内胚层或中胚层RNA使有缺陷的心肌形态学恢复正常，而且发现这种作用与RNA有剂量关系。
5、用卡介苗免疫豚鼠，该豚鼠对结核菌素反应由阴性转为阳性，提取这种免疫豚鼠的淋巴组织RNA（免疫RNA）注射入未免疫豚鼠，可以使未免疫豚鼠结核菌素试验转为阳性。但是如果注射未免疫豚鼠淋巴组织RNA则无效。这是免疫RNA特异性传递免疫信息的例证。
6、本实验室发现小鼠成纤维细胞培养物中添加不同组织来源的RNA，可以改变成纤维细胞形态，添加不同组织来源的RNA形态改变不同，如添加脾RNA成纤维细胞有球型表现。
7、本实验室的工作说明：小鼠成纤维细胞培养物中添加不同组织来源的RNA，可以使成纤维细胞核白蛋白基因和免疫球蛋白基因对DNase I消化的敏感性上升，同样表现出RNA组织来源特异性，即肝组织RNA促进消化敏感性的作用大于脑组织RNA。
（二）RNA对重组染色质DNase
I消化敏感性的影响
本研究室使用染色质重组系统，为RNA特异性改变基因结构提供了决定性证据。小鼠肝RNA及酵母tRNA分别配成0.1毫升内含0.10mg, 0.03mg和0.01mg浓度，加入小鼠脑染色质重组系统中，重组的染色质用DNase I消化，PCR法扩增白蛋白基因，观察消化率（参见附录）。DNase I消化与不消化的结果见图8.1，肝RNA随剂量的减少促进消化作用减弱；酵母tRNA在各个剂量均无显著消化促进作用，与不加RNA的对照基本相同。这些结果说明肝RNA可以增加白蛋白基因的DNase I消化率，但是酵母tRNA无此作用。
图8.1 肝RNA及酵母tRNA对重组染色质白蛋白基因DNase I消化敏感性的影响
从左向右，第1泳道为Marker；第2-3，4-5，6-7泳道分别为小鼠肝RNA
0.10mg，0.03mg，0.01mg；8-9，10-11，12-13泳道分别为酵母tRNA 0.10mg，0.03mg，0.01mg；14-15泳道为不加RNA的对照，双数泳道为不消化，单数泳道为消化。重组条件为0℃。
RNA对重组染色质DNase I消化敏感性，受温度、RNA浓度、RNA片段大小、互补性、各步骤的反应时间，甚至试剂加入顺序的影响。有时出现双向效应，推测RNA完全占据消化敏感位置可能会防止消化，但是这种消化敏感性下降与染色质超螺旋所造成的消化下降有本质的区别。
四、RNA群基因启动模型
（一）概述
多种不同顺序的RNA按硷基互补原则结合于新形成的DNA，最终使结合段DNA所代表的基因处于活化态，这就是RNA群基因启动模型的基本概念。RNA群基因启动模型设想基因启动要经历如下步骤（图8.2）：
1、形成RNA群 所有转录基因转录的RNA，其中主要是内含子RNA剪切为小片段混合在一起，即在核液中存在不同顺序、不同大小、不同比例的RNA分子；
2、竞争结合 DNA在RNA群中复制，RNA群中的RNA与新形成的DNA双链中的互补顺序竞争结合，在局部形成3链；
3、干扰核小体形成 3链区域（称为印记区）不能形成核小体，或形成不典型核小体，可能包括长连接子，由于负超螺旋造成的氢键断裂及在核小体的DNA链中形成线环。据认为DNA复制与组蛋白合成会同步进行，新复制出的DNA在几分钟内即会装配成核小体，那么RNA干扰核小体形成也应该在这几分钟内完成，核小体一旦形成（不管典型或非典型核小体）RNA既不再能改变它们的结构。
4、形成子细胞 DNA复制结束，形成染色体，倍增的染色体均分入2个子细胞中；
5、染色体松散 在子细胞中染色体松散，被RNA印记过的区域因为核小体不稳定则松散为10nm直径的染色质丝（疏松区），未印记过的部位以30nm直径螺线管为基本结构。
6、形成新的RNA群 疏松区的基因可能发生转录，转录又产生新的RNA，组成新的RNA群。正常情况下此时的RNA群与步骤“1”时的RNA群已经不完全相同，所以对DNA的印记也会有所区别。
RNA群
— ～ ▁ ▃
5' 3'
RNA 群 — ～ ▁ ▃
— ～ ▁
— ～
RNA 片段与新形成的
DNA 互补顺序竞争结合
5'
3'
RNA结合部位不能形成典型核小体
含有非典型核小体的区域在非组蛋白的作用下形成疏松结构；典型核小体区域仍为螺线管结构。
非组蛋白
图8.2 RNA群基因启动模型
细胞每分裂一次都要经历上述全过程，真核细胞中基因表达信息的传递可能是由DNA转录RNA，RNA印记DNA。正常情况下的基因启动模型示意图见图8.3。每个细胞中的DNA印记都来自于上一级细胞（母细胞），如果以RNA群中核苷酸顺序与DNA疏松区段对应，以RNA群中特定RNA的数量代表DNA印记强度，每一个细胞所产生的RNA群都不能完全代表该细胞的DNA印记类型，这是多细胞真核生物基因启动的一条原则。
真核细胞中基因表达信息的传递有很强的继承性，基因表达差异（分化）是在原有的基因表达谱上减少或/和增加某些基因的表达，进而形成新的RNA群，变化的过程属于渐变，所以分化谱系上，相近细胞的基因表达更类似。
转录
DNA(A1型印记) RNA群（A2型）
印记
转录
DNA(A2型印记)
RNA群（A3型）
印记
DNA (A3型印记)
RNA群（B1型）
图8.3 RNA群基因启动模型示意图 DNA上的特定印记如A1型，代表DNA上的特定疏松区段，由A1型DNA印记所转录产生的RNA不能代表A1型DNA的所有疏松区段，因为染色质疏松可以转录，但是不一定均转录，所以定名为A2型RNA群，依次类推。A2型RNA群与A3型RNA群多数成分相同，以数量增减为主。A3型印记DNA如何产生B1型RNA群？印记的DNA表现疏松，疏松部位的基因可以转录但是不一定全部转录，趋阻基因潜在活性基因还需要诱导条件才能转录。如果A3型DNA印记细胞接触到适当的条件，处于活化态的趋阻基因潜在活性基因会表达，于是在“原有”RNA群的基础上又添加新的RNA组分，原有RNA群中的某些成分也可能丢失，这样形成新的RNA群。
永生细胞与正常细胞不同，其基因启动过程见图8.4，在永生细胞中RNA群与DNA印记呈完全的循环关系。
印记
RNA群(T1型) DNA印记(T1型)
转录
图8.4 永生细胞基因启动
（二）RNA群
细胞中基因转录形成的RNA（mRNA前体和假基因产物）一部分通过核孔进入细胞浆，其余部分（主要是内含子RNA）在核液中逐步降解，细胞浆中的RNA降解成小片段后也可能重新回到细胞核。这样在核液中会存在不同顺序、不同大小、不同比例的RNA片段，如果把硷基相同或类似的片段归为一组，这些片段可以分为若干组，每组有一定的摩尔浓度。它们共同组成RNA群，RNA群是细胞中所有表达基因所转录RNA的总和。
真核细胞基因平均含有8个内含子，前体分子比成熟的mRNA大4-10倍，这就是说RNA中内含子RNA占绝大多数，所以RNA群中主要成分是内含子RNA；在与DNA互补区段竞争结合时，重复顺序所表达的RNA会形成更高的摩尔浓度，所以重复顺序起作用更大；RNA小片段有更好的灵活性且Tm值较低，所以推测RNA以小片段起作用为主。
一定时期的一定细胞中只有一部分基因转录，不同细胞中的DNA转录区段不会完全相同，这就意味着所产生的RNA群也有区别。
（三）硷基互补
DNA在细胞核里泡在RNA群中分段复制，刚复制的DNA，尚未包装成核小体，此时RNA群中如果存在互补RNA，则该RNA有机会与DNA中的一条链结合，在局部形成三链结构。RNA群中的RNA是否能够与DNA结合形成三链，属于随机事件，与杂交类似，取决于以下因素：
1、互补的RNA浓度（数量） 浓度越高发生互补的可能性越大。
2、RNA片段的大小 片段越大结合越牢，片段越小结合越快。从RNA探针结合DNA的实验看，RNA探针分子连续8个硷基互补或70%互补则可以产生显色，这样，小RNA片段起作用可能是主要形式，大片段RNA在体温条件下，短时间内很难形成正确的互补。
3、互补的适合性 硷基完全互补适合性最好，互补不好也有作用，呈数量关系。
4、结合强度 RNA/DNA的结合强度大于DNA/DNA的结合强度，这样在同时存在DNA、DNA、RNA互补顺序时，优先形成RNA与DNA复合物，如果RNA为小片段，其Tm值可以低于体温。
（四）不典型核小体
核心组蛋白在进化上有较强的保守性，体外重组实验表明核小体可以自动形成，推测核小体的稳定状态是唯一的，多种构型改变均可以导致不典型核小体形成，这样的区域不再形成螺线管结构，容易疏松。核小体的改变一旦形成，即不再需要RNA的作用（RNA与DNA结合或不结合均不影响形成新细胞后该部位疏松）。在分化过程中，同样的基因在不同的分化细胞中选择性表达，RNA是特异性的指示成分，RNA结合的部位干扰了典型核小体的形成，促进不典型核小体生成，不典型核小体区域易受非组蛋白影响发生染色质疏松。染色质装配时RNA单链与DNA双链形成的三链区，可以以如下方式干扰典型核小体的形成：
（1）长连接子 三链区不能形成核小体，这样形成长的连接子（连接相邻核小体的DNA），长连接子区与非组蛋白和RNA结合后不再形成螺线管结构；
（2）相位改变 三链区所形成的核小体发生相位变化（如4种核心组蛋白之间的位置，核心组蛋白与H1组蛋白的位置，DNA与组蛋白的位置等），这种发生相位变化的核小体容易受非组蛋白的影响发生疏松。
（3）DNA双链改变 RNA单链与DNA双链形成的三链区中，DNA双链的局部氢键和双螺旋结构被破坏，形成核小体后可能在几十bp范围内有负螺旋存在（梯型区域），该区域可能有某些单链性质，这种性质一旦形成则不再依赖RNA的存在。
（4）H1缺失 RNA如果结合在H1结合子区域（即146bp核心颗粒两翼伸展的各约10bp DNA），H1将不能结合在核小体。
（5）无核小体部位 连接子长度超过166bp，可以认为属于无核小体区，166bp为形成完整核小体的最小DNA量。
（6）非组蛋白加入 三链区提供了较多的结合位点，所以有理由说，组蛋白和非组蛋白联合构成核小体。
（五）作用子和感受子
1、作用子和作用子RNA 与DNA顺序互补使局部DNA形成3链的RNA称为作用子RNA；转录对应顺序的DNA称为作用子；相同或相近的作用子RNA构成组，然后构成RNA群。内含子、转录但是不翻译的DNA区域是主要的作用子部位。基因定位不同的作用子产生的作用子RNA可以有相同或相似的顺序，从而执行相同的功能。特定细胞中某些顺序的作用子RNA小片段可能浓度较高，而其它顺序可能浓度较低。
2、感受子 DNA上与RNA群中RNA互补结合，最终使该部分疏松的顺序称为感受子。感受子主要分布在内含子、基因侧翼特别是5'端非转录区。RNA群基因启动模型不要求基因活化需要全序列印记，但是要求基因全序列间隔印记，因此凡是可以间隔印记基因的RNA群都可以使该基因处于活化态，尽管这些RNA群的RNA顺序不同。这样可以解释不同的分化细胞中蛋白质表达的复杂搭配现象。同样的基因表达在不同的分化细胞中，所使用的作用子和感受子不同，所以共表达的其它蛋白质不同。作用子和感受子的划分不是绝对的，作用子也可以是感受子，反之也成立。
（六）子细胞差异
分化需要环境条件诱导，如果环境条件相同，两个子细胞会不会表达完全一致呢？RNA群基因启动模型从3个方面说明子细胞差异。
1、因为是随机事件，所以相同的RNA群对于DNA的结合不一定完全一样。所以衰老的过程除了程序性原因以外也有随机性因素参加。
2、DNA合成时，两条新合成的链不是在同一部位同时合成，细胞中的RNA群是在不断改变（由于RNA酶活性较高），由于这种时间差使同一部位的DNA接触不同时间的RNA群，所以印迹不同。
3、DNA合成时原来的组蛋白八聚体完全进入先导链DNA中，原来的组蛋白八聚体可能没有离开所结合的DNA，如果离开就会部分被新合成的组蛋白八聚体取代，因此，结合部位可能也无改变，随从链的核小体组蛋白是新合成的，推测核小体位置与先导链比较可能有变异。
（七）基因分级
1、细胞每分裂一代即为一级 该种分级方法涉及量变和质变。特定细胞中的表达基因所转录的RNA共同组成RNA群，RNA群是决定下一次DNA复制后基因能否启动的物质基础，如果按结构基因划分，一个结构基因的启动可能涉及到母细胞中所有的表达基因，这样细胞中的所有表达基因共同组成上级基因，RNA群印记的所有基因为下级基因。正常情况下，细胞每分裂一代，与上一代比较RNA群与DNA印记都会不同（包括量的变化），所以细胞每分裂一代就会产生不同的上级和下级基因。表达基因产生的RNA群，对新形成DNA上的同样基因有正反馈性启动作用，该种正反馈作用整体不能＞1.0，否则会成为永生细胞。在正反馈整体不能大于1.0的前提下，部分基因正反馈可以＞