第三章
分化的重要现象
一、不同动物的早期胚胎类似
从鱼类到哺乳类，它们的早期胚胎很相似，由受精卵发育到三胚层，再发育成有腮和尾的胚胎，彼此不易区别，但是到了胚胎发育的晚期即会表现出各自的形态。早期胚胎相似，表明它们都来自于共同的祖先，一切脊椎动物都来自于用鳃呼吸、有尾的共同祖先。德国学者用生物发生重演论（Law
of biogenesis）解释上述现象，认为：个体发育是种系发生简短而迅速的重演。这也说明进化（至少在胚胎早期发生时期）高等的生物是在原有的基础上添加新的取代旧的功能和形态，而不是完全丢失了原有的功能和形态。
二、分化的细胞决定
发育过程中，逐渐由“全能”局限为“多能”和最后趋向于“专能”稳定型的分化趋势，是细胞分化过程中一个普遍的规律。因此，从某种意义上来讲，细胞决定是发育潜能逐渐限制的过程，即选择基因表达的过渡阶段，此时细胞虽尚无可分辨的分化特征，但已具备了向某一特定方向分化的能力。
（一）胚胎细胞分化的潜能与决定
细胞分化是一种十分普遍的生命现象，多细胞有机体整个生命过程中均有细胞分化活动，但这种活动以在胚胎期为最频繁和最典型。多细胞有机体起源于一个单细胞的受精卵，从受精卵衍生出整个有机体的各种组织和器官，因此在发生潜能上受精卵属于“全能”细胞（totipotent
cell）。哺乳类胚胎在8细胞（属桑椹期）前，两栖类受精卵在囊胚期前，都具有“全能”性，以后迅速失去分化成完整个体的“全能”性。资料证明如将小鼠（或兔）8细胞胚胎分离后获得的任何一个卵裂球，均能培养发育成一个正常的胚泡，将此胚泡植入假孕母鼠（或兔）子宫，最后能发育成正常动物。海胆是无脊椎动物，在2细胞或4细胞时期分离卵裂球，每个卵裂球都能发育成完整幼虫，但这种幼虫的体积较小，受精卵第三次分裂后（8细胞），如对受精卵横切则动物半球发育为不含内胚层的囊胚，植物半球发育为不完整的胚胎。
从原肠胚细胞重排成三胚层后，随着细胞空间关系的改变和微环境的差异，三胚层衍生的未来组织器官的轮廓即开始决定下来。这些细胞在发生潜能上已开始出现一定的局限性，各胚层细胞只倾向于发育为本胚层的组织器官。
以两栖类为例，如将原肠胚早期预定将发育成表皮的细胞，移植到另一宿主胚胎预定发育为脑组织的区域，被移植的细胞在宿主胚胎中则发育成脑组织。而到原肠胚晚期阶段移植则发育成表皮，说明两栖类早期胚胎发育在早原肠胚和晚原肠胚之间的某个时期开始了细胞决定。
在以后的发育过程中，逐渐出现了各器官预定区，进一步局限其分化的潜能，具有演变为多种表型的能力，这种细胞称为“多能细胞”。
一个典型的例子是果蝇幼虫期的成虫盘（imasinal
disc），成虫盘所含的细胞虽未分化，但随时间的推移，不同成虫盘分别发育成腿、翅、触角和躯体其它部分。若把一个成虫盘移植到另一幼虫上，这些被移植的细胞不会失去它们的“决定”，仍然能产生成虫的相应部分。
（二）细胞决定的稳定性和遗传性
一旦细胞决定后，沿着特定类型分化的能力是很稳定的和可遗传的，果蝇的成虫盘是这方面的一个典型例子。成虫盘是幼虫体内的处于未分化状态的细胞团，变态后由成虫盘产生相应的腿、翅、触角等成体的不同结构；成虫盘位于幼虫体内不同位置，它们是预先向某种特定类型分化的已决定的细胞团。若将成虫盘移植到成体果蝇腹腔中，可以一直保持未分化状态不断地进行增殖。甚至经过许多次在果蝇腹腔中的移植，时间长达9年，繁殖1800代后，取出移植到幼虫体内，当幼虫变态时，被移植的成虫盘细胞便发育成相应的成体结构。如当初移植到成体果蝇腹腔中的是翅成虫盘，则长成的便是翅，说明成虫盘细胞的决定状态很稳定并可遗传，这种稳定性和遗传性并不受增殖许多代的影响。
不仅正常细胞的细胞决定具有稳定性和遗传性，细胞决定对肿瘤细胞的性状同样起重要作用。肿瘤的特征也可以相对稳定的遗传，最近本研究室对S180（小鼠肉瘤，1914年建株）,
H22（小鼠肝癌，40年代建株）实体瘤的组织学特征进行了观察，虽经多次传代这些肿瘤仍保留原来肉瘤和肝癌的组织学特征。
（三）转决定
一般胚胎细胞一旦决定，沿着特定类型进行分化的方向是稳定的，但在果蝇中发现某种突变体或培养的成虫盘细胞中有时会出现不按已决定的分化类型发育，而生长出不是相应的成体结构，这种现象叫转决定（transdetermination）。这是由于成虫盘细胞发生了转决定，改变分化方向的结果。转决定现象表现了从一种遗传状态转变成另一种遗传状态，是遗传性突变的结果。因为用改变DNA结构顺序的化学突变剂处理并不影响转决定的发生机率，其最主要的特点是转决定时是一群细胞而不是单一细胞发生变化，若以X射线照射果蝇幼虫，成虫盘中产生一个突变细胞，由这个突变细胞产生带有一种遗传特征的细胞克隆，以其突变特征与周围其它细胞相区别，在随后发生的转决定中，所出现的转决定组织中既含有突变类型的细胞也含有正常基因型的细胞。
三、克隆细胞、克隆动物和克隆植物
（一）克隆细胞
原核生物主要依靠克隆增殖，不发生衰老和分化。原生生物依靠克隆增殖和有性增殖，克隆增殖可以发生衰老，有性增殖可以复壮。这些可衰老物种与其分化有一定联系（见第二章）。
多细胞生物的各种细胞在通常情况下，于体外或体内做克隆培养都有一定的传代寿命。胚胎干细胞、某些畸胎瘤细胞、果蝇的昆虫盘或许是例外，这些细胞可以无限期传代，它们有正常的核型，经适当诱导可以分化为完全正常的组织或个体，所以不能认为这些细胞的遗传物质发生一级结构改变。
建株的转化细胞和肿瘤细胞可以在体外连续培养，不发生衰老表现。临床肿瘤组织标本分离为单细胞后做体外培养，可见多数肿瘤组织显示短时间的肿瘤细胞生长，但是最终培养瓶中的所有细胞均发生克隆衰老、死亡。能够建株的肿瘤标本是少数，即使已建株，繁衍起来的细胞也是来自标本中的极少数细胞，甚至有可能是一个细胞。
（二）克隆动物
水螅可以出芽繁殖，蚜虫可以孤雌生殖，属于自然的多细胞动物克隆，但是这种克隆增殖如果没有有性生殖复壮，往往要发生衰老。蛙的单性生殖，细胞核移入去核受精卵或其它细胞发育成完整个体（蛙、羊等），是人工动物克隆的典型例证。动物克隆的实验充分说明细胞分化不是由于基因丢失或永久性失去活性所致。
（三）克隆植物
在自然界里，多细胞植物发生克隆者多于多细胞动物。植物自身采用无性繁殖方法产生新个体的情况为数不少，比如落地生根，金边吊兰，半边莲，作绿地用的草坪草等等。竹子的地下茎盘根错节，繁殖成一片竹林。植物的这种克隆增殖不会因为代数的增加而退化。
用细胞培养的方法也可以克隆植物，一般先是从消毒的植物根、茎或叶片上切取一些小块组织，然后将它们放在含有适当营养物质和植物激素的培基上进行培养。组织块切口处的细胞会发生脱分化，成为分裂的细胞，并且可以继续不断的进行分裂增殖，形成愈伤组织（一种相对没有分化的细胞团）。通过营养物质和植物激素的适当配比，可以从这种愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织，并可由此再生出新的植株。
广泛的研究结果表明几乎植物体上所有各部分的组织细胞，包括根、茎、叶、花药、子房及幼胚等，均可通过诱导出来的培养细胞再生新植株。这些结果说明，植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性。从这方面说，植物细胞的培养优于动物细胞。然而，培养的植物细胞克隆，在不同植物种类之间，甚至在同种植物的不同基因型之间都有很大的差别。大量的试验结果表明，有些植物种类，如烟草、胡萝卜、矮牵牛、拟南芥、油莱、马铃薯、甘蔗等，它们的培养细胞很容易再生出新植株，并在继代培养中，能够长时期克隆并保持形成植株的能力。但是诸如小麦、玉米、水稻、大豆、棉花等，它们中的一些品种或品系的培养细胞也能诱导出再生植株；但是，它们许多品种在多次继代培养后，会丧失克隆和形成植株的能力。
四、细胞核与细胞质相互作用
（一）杂种细胞的基因表达
有些培养细胞系保持着原有组织的特征，根据这项进展可以开展一项新的研究：研究杂交细胞的分化特性的表达。在这种研究里，具有不同遗传状态的两种类型的细胞（各带有一个选择性遗传标记）相融合，并在只有杂交细胞才能生长的培养基里克隆，克隆细胞系（原始融合细胞的后代）被用来进行特征分析，在许多情况下是用来进行染色体组型的分析，以确定每一亲本细胞在杂种细胞遗传组成上的贡献。可以把在分化特性表达调控上的发现归纳为几个方面。
1、表现分化特性的体细胞与不表现这些特征的细胞融合的杂种细胞里，多数情况下，特殊的分化特性则要消失。然而，一旦融合细胞核失去了不表现该特征的亲本细胞的某些染色体后，这些特征又重新表达。同样，杂交细胞的表型与原来的基因剂量及其比例亦有关系。因此，如果原来“分化”的亲本细胞是四倍体的话，特殊的表型则消失较少。Deisseroth等认为，这种消失是由特异mRNA转录水平降低引起，他们描述了由人成纤维细胞和鼠红白血病（MEL）细胞融合的杂种细胞，这种杂种细胞失去了MEL亲本细胞所特有的诱导珠蛋白合成的能力。他们还用珠蛋白顺序的cDNA探针，证明鼠的珠蛋白DNA顺序存在于杂种细胞基因组内，但不能大量转录。
2、某些杂种细胞可以继续表达某种分化特征，尚不清楚为什么某些分化特征不消失。有一些例子，事实上可能反映了基因剂量效应。杂种细胞的生长方式可能对所观察的特征产生影响，如粘附性形态与红细胞表型的表达是不一致的。因此，当成纤维细胞与红细胞融合时，在基质上生长的细胞失去了诱导珠蛋白合成的能力；但在悬浮培养的细胞里，这种特征往往是可以表达的。
3、因为融合作用，表达一种分化特征的细胞可以诱导或激活其它细胞，表达它平时不表达的某种特化功能。这方面有个精彩的例子，即某些大鼠肝癌细胞与小鼠成纤维细胞或小鼠肝癌细胞与人白细胞构成的杂种细胞，分别合成小鼠或人的白蛋白。正如下面要详细讨论的，在分化特征激活过程中，融合细胞核内染色体的平衡也可能起某种作用。哺乳动物细胞含有某些因子，它们能够消除或激活特殊基因的表达，上面所总结的发现与这个观点是一致的。然而，自从最初发现这些现象以来，很少了解到所假定的那种调节因子的性质和作用方式。多数人在讨论中认为，该因子在转录水平上起作用，虽然研究过的多数细胞系统中，还没有对这种机制提出过证明。妨碍这一研究领域取得进步的主要原因，可能在于杂种细胞具有混合基因组的复杂性。在混合细胞质里，经常发生染色体丢失和其它的畸形现象。
通过检查最初的融合细胞，可以部分解决上面提到的与染色体丢失和重新排列有关的问题。将融合细胞从混合细胞群中分离出来，其中几种技术都涉及到用荧光激活细胞的分离法。融合细胞分析的研究指出，即使不丢失染色体，这些细胞也会有分化特征的丧失，例如大鼠HTC细胞（一种可以用类固醇诱导肝脏特有的酪氨酸氨基转移酶的细胞系）和大鼠BRL-62细胞（不具诱导特征的细胞系）融合24小时后，融合细胞很少或不含有此酶，而且用类固醇处理不发生反应。
对大鼠肝癌-小鼠成纤维细胞的杂种细胞的观察发现，融合12小时后，白蛋白合成能力丧失，而且与基因剂量无关，即用超四倍体的肝癌细胞实验时，也得到同样的结果。大约在融合后8－12天，某些杂种克隆重新表达大鼠白蛋白，再过几天，其中一些克隆又合成小鼠的白蛋白。只是在用超四倍体肝癌细胞实验时，这两种白蛋白的重新表达快得多，并且似乎在某种程度上与基因剂量有关。这些作者们得出结论，认为分化特征的丧失，是通过来自亲本成纤维细胞内的一种扩散因子起作用的结果。
细胞质内也可能含有激活杂种细胞基因表达的因子。Wrighte用大鼠L6成肌细胞（一种增殖细胞，可诱导分化和合成胚胎类型细胞骨架肌球蛋白）和鸡的分化的单核肌肉细胞构建了融合细胞。这种融合细胞不仅合成鸡的肌球蛋白，而且也合成大鼠胚胎和成体微梁肌球蛋白的轻链。正如作者指出的，该结果说明分化晚期的鸡细胞内存在着正调节因子，这种因子显然可以影响到能合成肌球蛋白细胞的基因表达。Linder等人记述了成熟的鸟类红细胞和几种哺乳动物非红细胞所形成的融合细胞内合成珠蛋白mRNA和三种正常类型的成体珠蛋白。虽然没有发现基因组“再程序化”（reprogramming），但是这个结果表明了哺乳动物的细胞质能够明显地诱导休眠的红细胞核再激活，并重新表达红细胞在休眠以前表达的遗传程序。
（二）胞质杂种和重建细胞的基因表达
为了更直接地研究核、质相互作用对细胞核基因表达变化的作用，运用了“细胞质杂交”（cybridization）和细胞重建（细胞核移植）技术。胞质杂种是由一个无核细胞或去核细胞与一个完整细胞融合而成的，开始时这个混合细胞质内只含有一个细胞核。细胞核的遗传标记（如抗溴脱氧尿苷）和线粒体标记（如抗氯霉素）的结合使用，可以把胞质杂种及其后代从未融合的亲本和同核体中分离出来。重建细胞是由一个无核细胞与一个核体（含一个细胞核、一层薄的细胞质壳及一层细胞外膜）融合而成，可以用类似的遗传选择技术分离重建细胞。此外，由于建立了确凿地鉴别和分离这种细胞的技术，现在可以对融合后立即发生的一些变化进行生化分析。通过胞质杂交或细胞核移植技术，把细胞核放入外源细胞质里由此产生细胞的表型将会发生什么变化呢？已有报道对此进行了一系列的介绍。某些著名的例子是：
1、去核的小鼠成纤维细胞与分化的大鼠肝癌细胞融合后，胞质杂种看上去丧失了合成白蛋白的能力。在融合形成后10－20小时，大多数胞质杂种的合成能力被抑制。这是一个明显的暂时现象，因为在融合48小时后又可以检测出大量的白蛋白。由此可以得出结论，合成能力的消失是通过一种短寿命的调节因子实现的。这种因子不能在没有成纤维细胞核的情况下重新产生。这也是与上述异核体的研究结果一致的一个概念。
2、把小鼠成纤维细胞核移植到去核的大鼠肝癌细胞中，发现杂种细胞具有另外一种肝脏特殊功能，即类固醇诱导的酪氨酸氨基转移酶活性的暂时激活，组织化学染色结果表明，几乎所有成功的重建细胞都被激活。虽然这种性能可以传递许多代（有的实验达100代之多），但它也是不稳定的，最终要从所有这些细胞中消失。对这种长期的、但最终不稳定的传递尚缺乏适当的解释。
3、去核的大鼠肝癌细胞与小鼠红白血病细胞融会，在胞质杂种中激活了第二种肝脏特有的酶，即苯丙氨酸羟化酶的合成。在这种实验里，用酪氨酸缺陷型培养基选择胞质杂种，即只有合成所研究的这种酶的细胞才能生长。虽然出现频率很低（10-5--10-6），还是得到了含小鼠基因组、并且合成小鼠苯丙氨酸羟化酶的细胞。还分析了胞质杂种具有的胞质供体细胞系的其它特征。在那些分析过的特征中，仅仅苯丙氨酸羟化酶可以诱导。
4、把转化的小鼠细胞系的细胞核移植到人成纤维细胞正常品系的胞质体，构建了杂种细胞。对这种杂种细胞的分析表明，核移植以后基因表达发生了无数的暂时性变化。这类细胞可大量构建，而且可以用一系列形态学、遗传学和免疫学手段加以明确鉴定。双向凝胶电泳技术分析杂种细胞内合成的蛋白质表明，发生融合3小时之后便可以检测出由细胞核指导的多肽合成。在这样早期检测出来的几种小鼠多肽是其亲本细胞中相当次要的多肽种类。一些其它多肽的合成只有在融合许多小时后才被检测出来。然而，大约在核移植后48小时，蛋白质合成的类型与亲本供体细胞核的几乎完全相似。这些细胞的整个形态学和详细的细胞骨架结构，发生了由人的胞质体供体型向小鼠细胞核供体型的变化。尽管这些变化很快，人们还是认为细胞质，细胞核杂种细胞为发现和研究调节真核细胞基因表达的机制提供了一个理想的机会。
五、细胞之间相互作用
细胞之间的互相作用直接影响细胞分化，肠道细胞分化需要多种异质性的细胞相互作用。在多细胞动物体内，细胞的互相作用有两种方式：在近距离的细胞之间，依靠化学物质的渗透发生作用，如胚胎的诱导现象；在远距离的细胞之间，通过体液或血液发生影响，如激素。
（一）诱导作用
胚胎诱导作用有两种方式：
1、在海胆胚胎细胞之间能互相诱导。胚胎的动物极半球趋于外胚层化，而植物极半球趋于内胚层化。这两种诱导作用方向相反，各成梯度系统，以接近两极的细胞作用为最大，远离两极的作用渐减。至于胚胎各个细胞分化前途就取决于所处地位上，这两种诱导作用的平衡关系。如果将桑椹胚沿赤道面切成动物极和植物极两个半球，分开培养，前者发育成没有肠管的幼虫，后者发育成不能内陷的肠管。
2、两栖类胚胎的诱导作用是定向的，例如，由脊索中胚层诱导外胚层形成神经板，再由神经板前侧的视杯诱导外胚层形成晶体，复由晶体诱导外胚层形成角膜。但是原肠胚表皮可以接受神经板的诱导，从而形成神经组织，后期原肠胚表皮接受神经板的诱导后，则分化成为晶体，尾芽期的表皮就不能接受神经板的作用了。然而诱导细胞和反应细胞之间的接触并非为成功的诱导所必需，当两者之间以微孔滤膜隔开后，诱导仍然有效，说明这是诱导细胞释放可溶性物质所致。
至于细胞分化的诱导，最典型的例子是间叶细胞对上皮细胞的作用。从后期胚胎取出的胰腺原基，以蛋白酶消化，就可分离成上皮和间叶两部分。在体外培养下，上皮细胞单独不能分化。如果将上皮和间叶细胞直接接触30至48小时后，上皮细胞就“决定”将来分化成胰腺。这时合成酶原所需的信使RNA，已从核运输到细胞质的核糖体上。如果在上皮细胞和间叶细胞间以滤纸隔开，仍然可以发生诱导。已知诱导物为大分子蛋白质。
（二）激素对细胞分化的作用
在昆虫变态中，幼虫的蜕变和化蛹都要受到激素的影响。脑激素是脑部所产生的神经内分泌物质。如果从已经成熟的幼虫中，将脑取出，就不能化蛹。再将脑回植到体内，则此幼虫又恢复化蛹能力，可知脑激素实际是一种促蜕皮激素。至于保幼激素，则由咽侧体产生，能促进幼虫发育，但阻止变态。如果将幼龄虫的咽侧体切除，则提前化蛹，变为成虫。当幼龄虫的咽侧体植入到蛹前期幼虫中，则停止化蛹，虽经脱皮，但仍继续保持幼虫状态。脱皮激素还能诱导多线染色体的一些带发生胀泡，在该处合成大量RNA。以RNA来编码，在上皮细胞质中合成蛋白质，以形成新壳。可见激素能够调节基因功能，使之“开放”或“关闭”，因而导致细胞的分化。
六、分化细胞中基因的特异性表达
细胞分化主要是特定基因有选择地表达的结果，导致产生一种类型的分化细胞，而另一种或几种表达的结果出现另一类型的分化细胞。研究资料表明，动物细胞表型的差异即细胞的分化，是由于各自表达不同基因的结果，一些胚胎细胞按其遗传潜能来说都是“全能”的，即包含有整套的遗传信息，然而它所携带的遗传信息在发育过程中并不都能表达，是按严格的时空顺序，有选择地表达其中的一部分。事实上分化细胞90%以上的基因被抑制，而只是有选择地表达其特异的基因，DNA/RNA分子杂交实验的结果表明基因组的转录只是其中的一小部分，分化过程涉及多个基因的表达改变，3T3细胞向脂肪细胞分化开始时，有人检测到50多个基因由静止向表达转变。
可以从两个方面分析细胞分化，第一个方面是，同一时期不同组织细胞蛋白质表达差异，第二个方面是，分化过程中蛋白质表达的时间性。
（一）同一时期不同组织细胞蛋白质表达差异
作者的研究室最近用60种抗体对着人胚胎7种不同器官组织做免疫组织化学染色，详细观察不同细胞类型的染色情况，分析蛋白质在细胞中的分布规律。该工作因为是同时比较，使用抗体多，又采用同一种标本，有一定代表性，现将该结果介绍如下：
1、目的 分化、衰老和肿瘤都伴随蛋白质表达的变化。一种细胞可以表达多种蛋白质，在通常情况下，一种蛋白质又可以在多种细胞中表达。研究蛋白质表达及分布规律对于进一步认识分化、衰老和肿瘤都有非常重要的意义。本研究通过对60种抗体免疫组织化学方法染色七种胚胎组织结果的分析，试图寻找蛋白质在组织细胞中的分布规律，包括以下两点内容：
第一、分析蛋白质分布规律属于以下四种分布规律的哪一种：
（1）各个蛋白质的表达是彼此互无联系的独立事件；
（2）蛋白质整组表达，即在一种细胞中表达的蛋白质在另一种细胞中不表达，如果在不同细胞中检测到相同的抗原性，亦属于不同的基因编码；
（3）若干种蛋白质以小组形式一起在细胞中表达，即该小组成分中有一种表达，其余成分也同时表达。每种细胞中可能有多个不同小组；
（4）蛋白质在细胞中的表达呈不固定成组搭配形式，即某些蛋白质在某种细胞中有成组表达倾向，但是又不绝对固定。
第二、将胚层起源较近的和起源较远的组织细胞中蛋白质分布情况做相关性分析，比较分析蛋白质的分布状况与胚层起源的关系。
2、结果 60种抗体染色七种器官组织，对应抗原没有一种仅在一种类型细胞中表达，CEA在3种细胞中表达，为表达细胞类型最少的抗原。以19种细胞类型两两做排列组合，共有171种组合，观察这些组合细胞中共同表达的蛋白质类型，每一组共表达的蛋白质在细胞类型中表达的实际频率为2/19，计算这些共同表达的蛋白质类型同时出现在一种细胞中的理论频率，将该值与实际表达细胞类型频率（2/19）应用EXCEL软件做统计学分析，发现171种组合中有98种组合P值小于0.05，其中有89种其U值分布在2.64—1.29×1014之间，P值小于0.01，有极显著性的统计学差异
3、结论
（1）用60种抗体对着7种胚胎组织染色，这7种胚胎组织共可以识别出19种不同类型的细胞。发现：多种蛋白质表达有成组分布倾向，这些成组分布的蛋白质在不同细胞中不呈随机表达。
（2）蛋白质在细胞中的成组分布，与细胞的分化起源有关，共同起源的不同分化细胞有一组共同的蛋白质，但细胞起源并不是蛋白质成组表达的唯一原因，有些非共同起源的细胞也有共同表达的一组蛋白质。
（3）成组分布的蛋白质中的任何一种都可以不成组表达，某基因表达的蛋白质在一种细胞中与一组蛋白质搭配，在另一种细胞中却与另一组蛋白质搭配。这符合本试验“目的”中提到的第四种情况——蛋白质在细胞中表达呈不固定成组搭配形式，即某些蛋白质在某种细胞中有成组表达倾向，但是又不绝对固定。还应该考虑到，蛋白质在某类细胞中的表达存在中间状态，染色强度和细胞染色比例都存在量的差异。蛋白质的细胞表达为什么呈现这种复杂表现呢？又如何调控？作者提出“RNA群基因启动模型”解释真核细胞蛋白质表达事件（见第八章）。
（二）分化过程中蛋白质表达的时间性
1、珠蛋白基因表达的时间性 脊椎动物不同发育阶段基因表达变化研究较多的是珠蛋白基因（globin gene），人类β样珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂，以5’-ε-Gγ-Aγ-φβ-δ-β-3’的顺序排列，约60kb。在胚胎发生中前后共产生5种β样（β
like）肽链，ε、Gγ-Aγ、δ、β，这些肽链分别由相应的结构基因密码（φβ为假基因不能密码蛋白质）。因此，β样珠蛋白基因实际上是个基因家族。这些肽链的氨基酸序列基本相同，但有差别，如β与δ间和β与Gγ间分别有90％和80％以上的氨基酸序列是相同的。
随着胚胎发育，β样珠蛋白出现的情况有所不同。胚胎型ε-珠蛋白基因首先在胚胎卵黄囊血岛中表达，随后ε-珠蛋白基因关闭，
Gγ-Aγ基因于胚胎第4-5周开始表达，第7-8周达高峰，一直维持到胚胎第32周表达水平逐渐下降，出生时约占β类珠蛋白的80%。1岁时降到成人水平，仅占β类珠蛋白的0.3-1.2%。整个胎儿期Gγ/Aγ比值较稳定，约为7/3。正常成人的血液中还含有少量δ珠蛋白。
处于决定状态的前体细胞（precursor cell，即被决定向原成红细胞方向分化的细胞），尚未产生珠蛋白，若用32P-磷酸盐分别掺入前体细胞和原成红细胞，如前体细胞此时珠蛋白基因表达，那么，RNA聚合酶就会与珠蛋白基因DNA结合并迅速转录成具有32P标记的RNA。此时用克隆的胚胎型β-样珠蛋白基因DNA与之杂交，结果只有在原成红细胞中有杂交反应，而前体细胞中的RNA不与之杂交，说明前体细胞的胚胎型珠蛋白基因在转录上处于休止状态，直至发育到原成红细胞时其基因才被活化，说明人体珠蛋白基因表达具有严格的红系组织特异性。
β样珠蛋白的表达呈顺序出现，是表达ε-珠蛋白的细胞发育成表达γ继而表达β-珠蛋白的细胞呢，还是这几种β-样珠蛋白的表达在细胞水平不具有继承性？试验支持后者的观点，即γ-珠蛋白表达细胞不是来自ε-珠蛋白表达细胞、β-珠蛋白表达细胞也不是来自γ-珠蛋白表达细胞。给经X线照射的小鼠移植骨髓，然后检查脾脏中的细胞结节，发现红系细胞是由非红系细胞产生的，并不包含所有的β样珠蛋白，这说明在分化上不是表达ε-珠蛋白的细胞发育成表达γ继而表达β-珠蛋白的细胞。
2．反式调控因子 人β-样珠蛋白基因转录的控制是由具有激活或阻抑作用的反式调控因子（其基因位于不同染色体）与不同顺式调控元件（位于同染色体）相互作用的结果。与人β-样珠蛋白基因转录有关的反式调控因子分为通用转录因子（如CP1，SP1等）和红系组织特异因子（如GATAl，NF-E2等）。这些转录因子与珠蛋白基因调控区的相应结合位点相结合，有的转录因子不止1个结合位点，GATA1结合位点常与其它转录因子的结合位点相重叠，但当GATA1结合后，便排斥其它转录因子的结合。一些反式调控因子的浓度（或活性）在不同发育阶段发生变化，只有转录因子间某种特殊的协调作用才能触发珠蛋白基因的转录，特别是发现某些通用转录因子（如SP1）和某些红系反式调控因子（如GATAl）。
3、基因活化需染色质疏松 基因进行转录前必需使高度螺旋化的DNA解螺旋，才能使基因调节蛋白接近并与DNA相结合，触发基因转录，解旋的DNA暴露其DNase
l敏感点，易受酶解攻击，这种构象改变了的染色质（活性染色质）对DNase l具有高敏感性。实验表明，在胚胎发育过程中，随着红细胞的分化进程，相应于不同类型珠蛋白基因表达前后，其DNase
l敏感位点发生不同的变化。在珠蛋白基因表达过程中，染色质解旋结构的变化依赖于5’上游远侧端的LCR（基因座位控制区，有类似增强子活性）。在一些地中海贫血症病人中发现含有珠蛋白结构基因的染色质中缺乏或部分缺乏LCR，即使β-珠蛋白基因及其近侧端调控区结构完整，也不能表达β-珠蛋白，是因为β-珠蛋白结构基因仍处于非活性状态，保持对DNase
l的抗性。说明这些地中海贫血症所以缺乏β-珠蛋白，是由于红细胞在发育过程中失去染色质解螺旋能力的结果。同时，用转基因小鼠的实验表明，当用没有与LCR重组的单纯人ε、γ和β-珠蛋白基因分别转人小鼠中，发现ε-珠蛋白基因根本不表达，γ和β珠蛋白基因表达水平很低。除非与LCR重组后才能提高表达水平，说明哺乳类β样珠蛋白基因表达前的染色质解螺旋是依赖于红系组织专一性的LCR存在。
活化基因所在的染色质区域的基因结构变得更开放，因此同不活化的基因相比这部分DNA表现出对DNase
I较高的敏感性，称为DNase I敏感区域。DNase I敏感区域中更敏感的部分称为高敏感点，主要分布在启动子范围内。凡是合成珠蛋白的细胞株内，不管合成5类珠蛋白的任何一种，都在基因群的5’上游和3’下游远距离处出现超敏感点（对DNase
I的敏感性高于高敏感点），而不合成珠蛋白的细胞株不存在这些超敏感点，超敏感点在5’和3’端成对出现，相距70-85kb,在超敏感点之间的β样珠蛋白基因是潜在的可活化基因。类似于β-珠蛋白基因簇超敏感点在其它基因也有报道，例如鸡的卵白蛋白基因群分布在约100kb
DNA中，它的5’和3’也是以DNase1超敏感点作为界限。
在重组实验中，0.35 mo1／L NaCl抽提的染色质非组蛋白或纯化的HMGI4和HMGI7加到脱HMG的染色质中，珠蛋白基因又恢复了对DNase
I的敏感性，HMG蛋白本身没有组织特异性，从脑组织抽提的HMG同从红细胞抽提的HMG一样可引起从红细胞分离的染色质中珠蛋白基因对DNase 1的敏感性，但是不能提高从脑组织分离的染色质中的珠蛋白基因对DNase
l敏感性。因此，HMG蛋白是导致基因对DNase I敏感的物质之一，但是决定什么基因同HMG结合，即决定专一性地提高特定基因对DNase I敏感性的因子并非HMG。
DNase I高敏感区内的DNA可能没有装配在核小体内，而是由一整套转录机构占据了这个区域。SV40（一种DNA病毒）启动子及DNA复制起点同T抗原（一种病毒产生的蛋白质）特异结合后表现出对DNase
I的高敏感性。爪蟾5S RNA基因同它的转录因子TFIIIA结合后也出现同样的情况。据推测这些调控蛋白同DNA特异地结合以后，妨碍了核小体的形成。对珠蛋白基因表达而言，情况可能也相似，它的表达受到特定的调控蛋白所控制。鸡βA珠蛋白基因同质粒构成一个重组DNA后，加进鸡组蛋白以及爪蟾的核抽提物（包含核小体装配因子），这样重组的核小体在βA启动子区域内不出现高敏感区，但是若在加组蛋白和爪蟾核抽提物之前预先加入发育到12－14天的鸡红细胞核抽堤物，在这样重组的核小体中，βA珠蛋白启动子区域是对DNase
I高敏感的。鸡发育到这个水平，细胞主要是合成βA珠蛋白，然而，如果加入才发育5天的红细胞核抽提液，或者加入脑细胞核抽提液，都不能诱使βA珠蛋白基因的启动子变成DNase
l高敏感性。脑细胞不含βA珠蛋白，发育才五天的雏鸡只合成胚胎型ρ珠蛋白而不合成成年型βA珠蛋白。因此在鸡发育到需要合成βA珠蛋白时细胞会产生某种蛋白质能特异地同βA珠蛋白基因结合，导致它的启动子区域的结构变得比较开放，为基因转录作好准备．另一个有趣的观察是鸡红细胞核因子加入次序影响试验结果，红细胞核因子首先同珠蛋白基因保温，然后加入组蛋白和核小体装配因子，重组的核小体可出现DNase
1高敏感区，如果红细胞核因子同其它蛋白质同时或稍后加入到DNA中，则不能重组成对DNase 1敏感的核小体。因此这提示珠蛋白基因活化过程至少要经历一次DNA复制。
(吕占军 王秀芳）
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